单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）是引发食源性疾病的重要病原体，可导致严重的脑膜炎和败血症。传统检测方法如细菌培养耗时长达数天，而PCR和ELISA虽提速却依赖昂贵设备。更棘手的是，新兴的CRISPR/Cas12a技术虽能实现高灵敏度检测，但其依赖靶序列中的PAM（原间隔相邻基序）特性，极大限制了应用范围。如何突破PAM限制，建立快速、普适的检测体系，成为食品安全监测领域的核心挑战。

吉林省科技发展计划资助的研究团队创新性地将λ核酸外切酶（λ-exo）与解旋酶依赖性扩增（HDA）结合，构建了无PAM限制的CRISPR/Cas12a荧光传感器。该技术通过HDA扩增L. monocytogenes的hlyA基因，利用λ-exo特异性剪切5'磷酸化单链的特性，将双链DNA转化为单链DNA，从而绕过PAM序列激活Cas12a的转切割活性，最终通过荧光信号实现检测。研究证实，该系统检测限低至11.5 CFU/mL，且无需复杂设备，为资源匮乏地区的病原体监测提供了新工具。

关键技术方法

1. HDA扩增：利用解旋酶替代热变性，实现hlyA基因的恒温扩增；
2. λ-exo剪切：特异性降解5'磷酸化链，生成激活Cas12a的单链DNA；
3. CRISPR/Cas12a信号转换：通过HEX/BHQ1荧光报告系统实现信号输出。

研究结果

Feasibility of the strategy
凝胶电泳和荧光分析证实，当存在目标菌株时，HDA能高效扩增出预期产物（条带清晰），而λ-exo处理后产物迁移率改变，表明成功生成单链DNA。阴性对照组无信号产生，验证了系统的特异性。

Conclusions
该传感器通过λ-exo的定向剪切作用，首次实现了不依赖PAM序列的Cas12a激活，将检测灵敏度提升至11.5 CFU/mL。由于CRISPR系统的可编程性，仅需更换crRNA即可扩展至其他病原体检测，在食源性疾病暴发应急响应和基层医疗检测中具有重要应用价值。

讨论与意义
研究突破了CRISPR检测中PAM序列的“枷锁”，通过λ-exo与HDA的协同作用，为核酸即时检测（POCT）提供了新范式。相较于前人报道的LAMP-CRISPR或RPA-CRISPR体系，该方法避免了不对称扩增的效率损失，且适用于更多靶基因。未来通过微流控芯片整合，有望开发成便携式检测设备，推动病原体监测技术的普惠化发展。